| |  | | 中草药降害技术研究与应用 | | 来源：中国烟草在线摘自中国烟草科教网 作者： 天津卷烟厂：孟庆乃 郑晓晖 张小利 发表时间：2003-9-9 | 摘要 本课题以“江山”牌卷烟开发为技术载体，对添加中草药的低危害卷烟研制开发过程中涉及到的问题进行了较为系统的研究。研究了低危害“江山”牌卷烟的配方技术，形成了一套比较完善的低危害“江山”牌卷烟配方技术；对低危害“江山”牌卷烟调香技术进行了大量试验研究，掌握了比较成熟的低危害“江山”牌卷烟调香技术，解决了低危害“江山”牌卷烟协调性问题；对中草药理论、中草药提取分离和配方技术进行了相关研究，研制出一个具有明显减害效果的中草药料液配方；对低危害“江山”牌卷烟相关工艺进行了研究，解决了低危害“江山”牌卷烟在线生产中的一些关键问题，设计出一套合理的低危害“江山”牌卷烟在线工艺标准；研究了中草药对卷烟烟气中有害物质的降低作用，建立了卷烟烟气中中草药有效成分的捕集方法，测定了中草药的捕集转移率，建立了低危害“江山”牌卷烟的设计、筛选及质检的技术。
关键词 低危害卷烟 配方 调香 降害技术 “江山”牌卷烟
中国拥有丰富的中草药资源，有悠久的中草药研究历史。历史资料记载的大量中草药资源和中草药理论，是发展低危害卷烟，形成具有中国特色卷烟十分宝贵的资源和优势。选择药物烟剂作为防治疾病的方法，在我国古代医药史文献中早有记载。清代赵学敏《串雅外编》记载了运用“烟熏疗法”治疗“水肿上气”、“冬月喉痹”等疾病，在“一切咳嗽”一节中说：“不问远近，昼夜无时，佛耳草五十文，款冬花二百文，熟地黄二两，共研末，每二钱于炉中烧之，以简吸烟，咽下有涎吐出，两服愈”。这说明我国医药学家早已发现某些中草药燃烧时的烟雾扩散，有防治疾病作用。受祖国医药学中的“烟熏疗法”等理论启发，烟草行业的科技工作者开始了添加中草药的低危害卷烟产品开发的探索。
近年来，我国烟草行业对卷烟降焦进行了大量的研究，逐渐掌握了比较成熟的降焦技术，与此同时，对焦油的认识也在不断深入。另外，随着国产卷烟平均焦油量的大幅降低以及受原料的制约，降焦难度越来越大，尤其是面临迫在眉睫的国际卷烟市场竞争，我国烟草业在对卷烟有害成分进行了大量研究的基础上，开始了为提高卷烟安全性而进行的选择性降低卷烟有害成分等低危害技术的深入研究，取得了一些研究新成果，掌握了一些相关的技术方法。部分卷烟企业联合国内科研院所、医药行业，运用传统的中医药学原理，在卷烟中添加中草药成分，研制成功了一些独具特色的卷烟产品，其技术成为了我国低危害卷烟研究的重要组成部分。
1 低危害“江山”牌卷烟产品设计研究
1.1 材料与试剂
烟叶、中草药提取液、香精香料、各种透气度卷烟纸和成型纸、各种吸阻滤棒及各种化学试剂。
1.2 仪器设备
天津卷烟厂生产线、JJZ-Ⅱ型常规分析用吸烟机、SKALAR化学自动分析仪、AEU-210电子天平、METTLER TOLEDO PB303D电子天平、DL-102电热鼓风干燥箱等。
1.3 检测方法
按卷烟国标、行业标准及SKALAR ANALYTICAL等方法进行。
1.4 感官评定
按GB/T5606.4-1996进行卷烟样品的感官评价。
1.5 单料烟原料
单料烟叶是卷烟产品的基础原料，研制内在质量较高的卷烟产品，必须从烟叶原料的选择开始。依据单料烟化学分析结果和感官评吸结果进行高品质低危害“江山”牌卷烟配方设计，从大量单料烟中挑选适宜的烟叶原料，从根本上保证卷烟产品的高品质特点。在具体的单料烟选择中，主要遵循以下5点：选择与配方目标相适应的各种烟叶分别作为主料烟，填充料和调味料烟叶，确定相互间的比例，并使之能和谐地组合在一起，由此确定构成整个卷烟香气和吃味的基础；配方的主料烟叶原料，以烟叶等级为基础进行选择，烟叶等级是根据统一的标准对烟叶的外观和内在质量做出的评价，这种评价虽然不是由配方者本人做出的，但它具有普遍的意义；卷烟的香气类型，这是一项不能由卷烟的品质来衡量的因素，但却与卷烟的香气风格直接有关，卷烟的香气风格是由配方烟叶的香气向相互达成香气平衡所形成的和谐统一的香气特征；烟叶原料的主要化学指标状况，从化学指标上找出原料烟叶之间的互补关系，这种互补关系在一定程度上与烟叶吃味品质间的互补关系是相一致的，通过对原料主要化学成分分析，可以为叶组配方、加料、加香提供一系列的相关信息，并成为配方选料的重要参考依据；单料烟的感官质量，卷烟作为一种特殊消费品，感官质量是一项重要的技术指标，而单料烟的感官质量与卷烟叶组配方的感官质量有直接的相关性，因此单料烟的感官质量是选料的关键。
选用结果大致为：进口优质烤烟和云南上等烟叶作为主料烟，香气类型侧重清香性，化学成分范围大致确定在，总糖22-28%、总氮1.8-2.2%、烟碱1.6-2.5%、蛋白质8-12%，感官质量大部分为香气量充足、劲头适中、刺激较小、余味较舒适的烟叶，这样可以保证卷烟产品有充足的高档烟香，同时保持酸碱平衡，尽量去除杂气刺激等不利因素。
1.6 叶组配方设计
1.6.1 多产地，多品种，多等级，小比例
多等级多部位配方，不仅能保证卷烟产品烟香丰满协调，而且能保证卷烟风格和质量的长期稳定。充分发挥各种烟叶原料各自的优势，互相弥补不足，改良烟香的单调感，使卷烟燃吸时香味谐调优雅。由于配方结构中所采用的烟叶产地、等级、类型较多，各种烟叶在配方中所占比例相对较小，即使在生产中某一烟叶原料出现短缺，亦较容易找到合适的替代烟叶原料，利于生产过程中保持卷烟风格和内在质量的稳定。
1.6.2 适量应用香气充足、烟气浓度较高的原料
针对“江山”卷烟产品烟气焦油量14mg/支要求，要充分利用香味充足、烟气浓度较高的烟叶，以保证采取降焦工艺措施后仍能满足消费者的要求。一般上部烟叶烟碱含量较高，烟气粗糙，香气浓度高；下部烟叶的燃烧性较好，香气平淡，焦油产生量较低；中部烟叶的糖含量较高，焦油产生量较高。由于“江山”产品的品质要求，不添加梗丝、再造烟叶，膨胀烟丝等填充料，下部烟比例不应过高，上部烟的比例也要保持在一个较低的水平，因此高品质的中部烟叶是“江山”产品叶组配方的主料烟叶。
1.6.3 叶组配方的协调性和生理强度
“江山”卷烟的叶组以中部烟叶为主料烟叶，烟碱含量适中，生理强度较易调节。其协调性也处理到了一个较好的水平，减少了加入中草药以后解决协调性的难度。
1.6.4 酸碱平衡
适当的糖碱比不仅能保持烟气的酸碱平衡，而且能够使烟气中游离态烟碱的比例保持在适当的范围内，减轻刺激性，使烟气柔顺，平和。一般认为，在卷烟燃烧过程中，烟草中的还原糖会与氨基酸发生Maillard反应（即棕化反应），产生许多重要的香味成分。因此，“江山”牌卷烟叶组配方设计的糖碱比适中，保证了卷烟香气优美、吃味醇和，达到良好的谐调性。
1.7 加香加料
中草药作为一种药材，有其自身的特点和性能，中草药提取物具备中草药的一般特性，有特殊的药草香气，这种香气与烟香有一定的冲突，过量会表现出药物给口感带来的严重不适，但如果运用得当，剂量合理，反而可以作为烟香的借鉴和补充。以不掩盖卷烟本身的香气为准，要与烟味相谐调、吃味纯正、芳香微露、余味舒适，加入的中草药要与香、料以及烟叶配方相辅相成，达到预期的设计要求。加料的目的主要是增强燃吸期间卷烟烟味与其柔和性之间的平衡。通过改善每种烟叶的吸味特征，以使烟气更谐调，增强烟草成分的香气，解决“江山”料液设计过程与中草药的协调性问题。加香可以确定“江山”牌卷烟的风格，衬托和丰富烟香，对适度丰富烟气、增加香气的量和厚实感方面有很大作用，对协调药香也起着至关重要的作用。
通过反复试验，最终确定了卷烟的配方。该叶组配方的总糖25.12%，总氮1.98%，烟碱2.48%，蛋白质10.03%，糖碱比10.13%。感官评吸结果表明：“江山”牌卷烟风格独特，烟香纯正突出，香味充实，微透淡淡的药草香，清新高雅，与烟香充分谐调，劲头适中，吸味平顺，口感舒适，无杂气，无刺激，充分体现了高品质卷烟的内涵。
1.8 工艺研究
卷烟加料能够有效地弥补烟叶原料吸味质量之不足，矫正吸味、减少刺激、杂气和改善余味，进一步提高和完美卷烟吸味质量，是保证卷烟内在品质的重要因素。不同的卷烟叶组相对应的料液配方不同，料液的理化性质也存在着差别，因此，必须针对不同料液配方进行研究，找出合适的工艺条件。“江山”卷烟所用的料液中含有大量的药物成分，与其它牌号的普通卷烟相比，“江山”牌卷烟加料量增加30%左右，而且料液比重大，粘度较高。靠自控加料方式，调整料液温度和加料筒转速等措施无法解决加料不均等问题，在认真分析论证后，对加料装置及其工艺参数进行了大范围的调整和改进。
1.9 卷烟材料研究
1.9.1 卷烟纸试验
试验过程中，选取国内外相关卷烟纸样品多种，考察对比不同透气度的卷烟纸对烟气指标及吸味的影响,由检测数据和回归分析发现，不同透气度卷烟纸对主要烟气指标有明显的影响，透气度与焦油量存在明显的线性关系（总粒相物R2=0.87560，焦油R2=0.90923，烟碱R2=0.58509），使用高透气度卷烟纸能够调节燃烧率，影响抽吸次数，能引入空气来稀释烟气，有助于焦油释放量的减少。随着卷烟纸透气度的提高，焦油量随之减少，试验发现， 60CU卷烟纸比30CU卷烟纸的焦油量平均降低近2mg/支，而且60CU卷烟纸焦油量在设计值（14mg/支）以内。因此选用60CU卷烟纸是比较适宜的。进一步研究发现，选用60Coresta卷烟纸不仅卷烟的焦油产生量比较适宜，物理性能也较好，燃烧后包灰均匀、不发散，灰色较白，燃烧均匀。
1.9.2 卷烟滤棒
采用60CU卷烟纸进行试验，研究不同滤棒压降对卷烟焦油递送量的影响。回归分析表明，卷烟焦油递送量与滤棒压降在一定范围内呈明显的线性关系，卷烟焦油量随滤棒压降的增大而降低。感官评吸结果表明，随滤棒压降的增加，烟气浓度稍有下降。当使用2700Pa压降的滤棒时，卷烟产品的焦油产生量能较好地满足设计要求，同时对感官无不良影响。
1.9.3 搭配试验
通过不同透气度卷烟纸与不同吸阻滤棒组合试验卷烟的烟气分析结果可以发现， 2400Pa/60CU和2700Pa/60CU组合试验的卷烟焦油量满足设计要求。不同组合试验对卷烟感官质量的影响较小，尤其对刺激、余味基本无影响。试验研究表明，当卷烟纸的透气度为60CU，滤棒压降为2700Pa时，“江山”牌卷烟的各项设计指标均能满足，能体现配方高品质特点：烟香丰满、细腻，香气质好、量足，无刺激，无杂气，吃味醇正，劲头适中，烟气流畅、柔和，浓度适中，余味干净舒适。
1.10 小结
最终产品选用优质进口和云南烤烟为主料，辅以其它地区优质烟叶组成“江山”叶组，天然香料和中草药协调，产品成功解决了药烟协调性的问题，卷烟成品香气高雅，药香清淡谐调，其它感官指标也完全具备高档烟的水平。工艺方面针对“江山”料液和其它特性进行了反复试验，辅助材料同样针对“江山”牌卷烟的要求进行研究，各项指标设定都有助于产品质量的提高，产品焦油量在14mg以内，符合设计目标。感官鉴定结果和烟气检测结果见表1和表2。
2 降低卷烟有害成分研究
2.1 卷烟烟气中TSNAs的分析
配制浓度为5000ng/ml的N-戊基-(2-吡咯基)亚硝胺溶液作为内标溶液，以二氯甲烷为溶剂。配制浓度为：内标浓度：5000ng/ml，NNN：100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，2000ng/ml，5000ng/ml；NAT：100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，2000ng/ml，5000ng/ml；NAB：30ng/ml，60ng/ml，150ng/ml，300ng/ml，600ng/ml，1500ng/ml ；NNK：100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，2000ng/ml，5000ng/ml的TSNAs标准系列溶液，以二氯甲烷为溶剂。
用抗坏血酸/甲醇溶液处理玻璃纤维滤片（92mm滤片使用50mg抗坏血酸，44mm滤片使用10mg抗坏血酸），滤片平衡后按YC/T 29-1996标准条件收集20支卷烟的粒相物。将得到的滤片放入250ml锥形瓶中，置于超声波发生器内用二氯甲烷分3次超声提取，第1次往锥形瓶内加100ml二氯甲烷，其余两次各加80ml，每次超声提取10min。将所有提取液经无水硫酸钠干燥后过滤，转移至500ml磨口圆底烧瓶中。将盛有提取液的圆底烧瓶连接旋转蒸发仪，通高纯氮气旋转蒸发，浓缩至约5ml待用。
碱性氧化铝在110℃下活化2h待用。层析柱保持洁净干燥，先加入30ml二氯甲烷，再用湿法将15g碱性氧化铝加到层析柱中，用玻棒搅拌氧化铝赶走所有气泡。用50ml二氯甲烷洗脱层析柱。当液面下降至氧化铝层时关闭层析柱活塞。
将浓缩样品一次加入层析柱，并用5ml二氯甲烷洗涤烧瓶壁，重复3次。洗涤液加入层析柱。用30ml二氯甲烷洗脱层析柱，不收集洗脱液。最后用100ml 8%甲醇/二氯甲烷（v/v）溶液洗脱层析柱，收集全部洗脱液。在洗脱液中加入1ml内标溶液，通高纯氮气将其浓缩到约30ml，再转移到50ml带刻度浓缩瓶，浓缩至1ml左右，最后转移到2ml色谱小瓶中，进行GC-TEA分析
气相色谱仪分析条件如下：
色谱柱：弹性毛细管柱30m×0.25mm×1μm，固定液 5%-二苯基-95%-二甲基硅烷
保护柱：弹性毛细管柱1m×0.32mm×1μm，固定液 5%-二苯基-95%-二甲基硅烷
程序升温：初始温度50℃，保持2min，10℃/min升至180℃，保持10min，10℃/min升至230℃，30℃/min升至260℃保持20min。
进样口温度：225℃
载气：氦气，恒流速2.5ml/min
进样量1μl，不分流，不分流时间0.75min，吹扫流量50ml/min。
热能分析仪分析条件如下：
热裂解温度： 550℃
接口温度：250℃
氧气流速：18ml/min
冷阱温度：-130℃（液氮/乙醇混合物）
按下式计算卷烟烟气中4种TSNAs的含量：
式中：m-每支卷烟TSNAs含量，ng/支；
a-由线性回归方程求出；
b-由线性回归方程求出；
ms-样品溶液中内标量，ng；
A-TSNA峰面积；
As-内标峰面积；
n-烟支数量，支。
2.2 卷烟烟气中苯并[a]芘的分析
配制浓度为20μg/ml的9-苯基蒽溶液作为内标溶液，以环己烷为溶剂。配制浓度为20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml的苯并[a]芘标准系列溶液，以环己烷为溶剂。在标准系列溶液中加入一定量的内标溶液，进行GC/MS分析，制作标准工作曲线。
按YC/T 29-1996标准条件收集20支卷烟的总粒相物。将得到的滤片放入100ml锥形瓶中，用移液管准确加入40ml环己烷。置于超声波发生器内超声萃取40min，静置待用。
准确移取10ml萃取液至固相萃取柱，分离完成后分2次加入30ml环己烷洗脱，洗脱速度为0.8～1ml/min。收集所有洗脱液。将盛有所有洗脱液的浓缩瓶连接到旋转蒸发仪上，在80℃、高纯氮气保护下旋转蒸发，浓缩至0.5ml，加入浓度为20μg/ml的9-苯基蒽内标溶液5.0μl，进行GC/MS分析。
分析在HP6890-5973MSD上进行，GC/MS条件如下：
进样口温度：280℃
电离方式：EI
离子源温度：230℃
进样量：1.5μL
分流比： 5︰1
载气：氦气，恒流流速1.2ml/min
色谱柱：非极性弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm
程序升温：初始温度150℃，升温速率6℃/ min至280℃，保持20min.。
扫描方式：SIM，选择离子为苯并[a]芘和9-苯基蒽的分子离子峰，对每个离子的监测时间为30ms。
按下式计算每个化合物的含量：
式中：m-每支卷烟苯并[a]芘含量，ng/支；
a-由线性回归方程求出；
b-由线性回归方程求出；
ms-样品溶液中内标量，ng；
A-苯并[a]芘峰面积；
As-内标峰面积；
n-烟支数量，支。
2.3 有害成分测试结果
“江山”牌卷烟经国家质检中心检测，结果表明，主要有害成分苯并[a]芘降低21.8%，烟草特有N-亚硝胺降低26.3%。
3 急性毒性试验
选取18～22g的健康小鼠540只，雄雌各半，随机分为江山牌卷烟组（20支烟/kg、25支烟/kg、30支烟/kg、35支烟/kg、40支烟/kg、45支烟/kg、60支烟/kg、65支烟/kg、70支烟/kg、80支烟/kg）和空白卷烟组（20支烟/kg、25支烟/kg、30支烟/kg、35支烟/kg、40支烟/kg、45支烟/kg、50支烟/kg、55支烟/kg）。每剂量组30只动物。将小鼠放入10000ml的容器内，用吸烟机吸烟，每分钟吸烟1次，每次2s，烟气量为35ml，并于2s内将烟气注入容器内。吸烟完成20min后，将小鼠从容器内取出，未死小鼠继续饲养7d。观察并记录小鼠行为活动、呼吸、饮食、皮毛、眼、粪便及死亡等情况。
试验结果表明，给小鼠吸“江山”牌卷烟和空白卷烟后，小鼠呼吸加快，跳跃，颤抖，咳嗽，尾上翘，闭眼，活动明显减弱，中毒症状随剂量的增加而加重，“江山”牌卷烟组和空白卷烟组比较，在相同剂量下，中毒症状无明显差异；未死亡动物均于吸烟后6h恢复正常。按Bliss's法计算，“江山”牌卷烟和空白卷烟LD50分别为34.4394±3.8605 g/kg和28.3578±1.8276g/kg，动物死亡情况见表4和表5。
4 长期毒性试验
选取健康大白鼠100只，体重100～120g，雌雄各半。按体重和性别随机分为正常对照组、空白卷烟组（3.6支空白卷烟/kg）、“江山”牌卷烟小剂量组（1.8支空白卷烟/kg+1.8支“江山”牌卷烟/kg）和“江山”牌卷烟大剂量组（3.6支“江山”牌卷烟/kg）。将大鼠放入10000ml的容器内，用吸烟机吸烟，每分钟吸烟1次，每次2s，烟气量为35ml，并于2s内将烟气注入容器内；吸烟完成10min后，将大鼠从容器内取出。连续吸烟90d，观察并记录大鼠行为活动、呼吸、皮毛、眼、粪便及死亡等情况；每周称动物体重和食量，观察动物体重和饮食变化。吸烟90d后，处理一半动物，做血液学检查（血红蛋白、红细胞数、血小板数、白细胞数及其分类）和血液生化学检查（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、总胆红素、总胆固醇及血糖）。最后处理动物，取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸（带附睾）及前列腺称重，求其脏器系数，并将上述脏器用福尔马林固定，做组织学切片观察。停止吸烟后15d，处理剩余一半动物，做血液学检查、血液生化学检查及病理组织学检查。
4.1 吸烟90d对大鼠一般状况的影响
与正常对照组比较，开始吸烟后大鼠全部活动明显减弱，呼吸加快且不规则，鼻腔分泌物明显增多，挠鼻，闭眼，30%大鼠出现跳跃现象，20%大鼠出现咳嗽现象；1周后约10%大鼠眼睛出现红肿，进而出现出血；1个月时约30%大鼠眼睛出血，全部大鼠眼睛红肿，跳跃现象消失，吸烟期间对照组动物死亡3只，空白卷烟组动物死亡2只，“江山”牌卷烟小剂量组动物死亡1只，“江山”牌卷烟大剂量组动物死亡2只，上述现象“江山”牌卷烟组与空白卷烟组比较无明显差异。空白卷烟组大鼠体重和饮食与对照组和“江山”牌卷烟比较有所减少，但无明显统计学差异（p＞0.05）。
4.2 吸烟90d对大鼠血液学指标的影响
吸烟90d后，取半数动物眼后静脉丛取血，检测血红蛋白、红细胞数、白细胞数及其分类。实验结果表明，给大鼠吸空白卷烟后，大鼠白细胞数明显降低（p＜0.05），而“江山”牌卷烟组大鼠白细胞数与对照组比较无显著性差异（p＞0.05）；吸空白卷烟和“江山”牌卷烟对上述其他指标无明显影响（p＞0.05）。
4.3 吸烟90d对大鼠血液生化指标的影响
吸烟90d后，取半数动物摘除眼球取血，做谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BIL)、总胆固醇(TC)及血糖(GLU)检测。实验结果表明，吸空白卷烟90d后，大鼠血清碱性磷酸酶和胆固醇均明显升高（p＜0.05），总蛋白明显降低（p＜0.05）；而吸“江山”牌卷烟90d后，大鼠血清碱性磷酸酶、总蛋白和胆固醇与对照组比较无明显差异（p＞0.05）。
4.4 吸烟90d对动物脏器系数的影响
吸烟90d后处死半数动物，摘取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸（带附睾）和前列腺称重，求其脏器系数。实验结果表明，空白卷烟组和“江山”牌卷烟小剂量组大鼠心脏重量明显增加，“江山”牌卷烟大剂量组心脏重量无明显变化，而吸烟90d对大鼠其他脏器系数无明显影响（p＞0.05）。
4.5 吸烟90d对动物脏器组织学的影响
吸烟90d后处死半数动物，摘取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸（带附睾）及前列腺，用福尔马林固定，做组织学切片。
组织学观察表明，吸空白卷烟后大鼠的心脏、肝脏、肺脏、肾脏及精子的生成均有不同程度的损伤；吸“江山”牌卷烟后大鼠的心脏、肝脏、肺脏、肾脏及精子的生成亦有不同程度的损伤，但对肾脏及心脏的损伤程度小于空白卷烟组，且对大鼠的精子生成无明显影响，对大鼠的肝脏和肺脏的损伤程度与空白卷烟组相当。
4.6 停止吸烟15d后大鼠的一般情况
停止吸烟后观察动物的一般情况。结果表明，各吸烟组动物行为活动、饮食、粪便和皮毛无明显异常，动物体重与正常对照组比较无明显差异（p＞0.05）；呼吸加快且不规则、鼻腔分泌物明显增多、挠鼻、闭眼、跳跃、咳嗽、眼睛红肿和出血现象全部消失，“江山”牌卷烟组与空白卷烟组比较无明显差异。
4.7 停止吸烟15d后对大鼠血液学和血液生化学的影响
停止吸烟15d后处理剩余动物，做血液学检查（血红蛋白、红细胞数、血小板数、白细胞数及其分类）和血液生化学检查（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、总胆红素、总胆固醇及血糖）。结果表明，空白卷烟组和“江山”牌卷烟组血液学和血液生化学指标与正常对照组比较无明显差异（p＞0.05）。
4.8 停止吸烟15d后对大鼠主要脏器系数的影响
最后处理动物，取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸（带附睾）及前列腺称重，求其脏器系数。实验结果表明，空白卷烟组和“江山”牌卷烟组大鼠的脏器系数与正常组比较无明显差异（p＞0.05）
4.9 停止吸烟15d后对大鼠脏器组织学的影响
并将上述脏器用福尔马林固定，做组织学切片。结果表明，停止吸烟15d后，空白卷烟组大鼠精子的生成恢复正常；肾脏亦有所恢复，与“江山”牌卷烟组比较无明显差异；心脏、肝脏和肺脏无明显恢复。
4.10 小结
将大鼠放入10000ml的容器内，用吸烟机吸烟，每分钟吸烟1次，每次2s，烟气量为35ml，并于2s内将烟气注入容器内；吸烟完成10min后，将大鼠从容器内取出。连续吸烟90d，观察“江山”牌卷烟对大鼠的长期毒性作用。一般状况观察结果表明，吸空白卷烟（3.6支空白卷烟/kg）、“江山”牌卷烟（1.8支空白卷烟/kg+1.8支“江山”牌卷烟/kg和3.6支“江山”牌卷烟/kg）后大鼠全部活动明显减弱，呼吸加快且不规则，鼻腔分泌物明显增多，挠鼻，闭眼，30%大鼠出现跳跃现象，20%大鼠出现咳嗽现象，1周后约10%大鼠眼睛出现红肿，进而出现出血，1个月时约30%大鼠眼睛出血，全部大鼠眼睛红肿，跳跃现象消失，吸烟期间对照组动物死亡3只，空白卷烟组动物死亡2只，“江山”牌卷烟小剂量组动物死亡1只，“江山”牌卷烟大剂量组动物死亡2只，上述现象说明“江山”牌卷烟组与空白卷烟组比较无明显差异。空白卷烟组大鼠体重和饮食与对照组和“江山”牌卷烟比较有所减少，但无明显统计学差异。血液学（血红蛋白、红细胞数、血小板数、白细胞数及其分类）检查实验结果表明，给大鼠吸空白卷烟90d后，大鼠白细胞数明显降低（p＜0.05），而“江山”牌卷烟组大鼠白细胞数与对照组比较无显著性差异（p＞0.05）；吸空白卷烟和“江山”牌卷烟对上述其他血液学指标无明显影响（p＞0.05）。血液生化学（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、总胆红素、总胆固醇及血糖）检查实验结果表明，吸空白卷烟90d后，大鼠血清碱性磷酸酶和胆固醇均明显升高（p＜0.05），总蛋白明显降低（p＜0.05）；吸“江山”牌卷烟90d后，大鼠血清碱性磷酸酶、总蛋白和胆固醇与对照组比较无明显差异（p＞0.05）；吸空白卷烟和“江山”牌卷烟对上述其他血液生化学指标无明显影响（p＞0.05）。最后处理动物，取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸（带附睾）及前列腺称重，求其脏器系数，实验结果表明，空白卷烟组和“江山”牌卷烟小剂量组大鼠心脏重量明显增加（p＜0.05），而“江山”牌卷烟大剂量组心脏重量无明显变化（p＞0.05）；吸烟90d对大鼠其他脏器系数无明显影响（p＞0.05）。组织学观察结果表明，吸空白卷烟后大鼠的心脏、肝脏、肺脏、肾脏及精子的生成均有不同程度的损伤；吸“江山”牌卷烟后大鼠的心脏、肝脏、肺脏、肾脏及精子的生成亦有不同程度的损伤，但对肾脏及心脏的损伤程度小于空白卷烟组，且对大鼠的精子生成无明显影响，对大鼠的肝脏和肺脏的损伤程度与空白卷烟组相当。
停止吸烟后观察动物的一般情况。结果表明，各吸烟组动物行为活动、饮食、粪便和皮毛无明显异常，动物体重与正常对照组比较无明显差异（p＞0.05）；呼吸加快且不规则、鼻腔分泌物明显增多、挠鼻、闭眼、跳跃、咳嗽、眼睛红肿和出血现象全部消失，“江山”牌卷烟组与空白卷烟组比较无明显差异。停止吸烟15d处理剩余一半动物，做血液学检查（血红蛋白、红细胞数、血小板数、白细胞数及其分类）和血液生化学检查（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、总胆红素、总胆固醇及血糖）。结果表明，空白卷烟组和“江山”牌卷烟组血液学和血液生化学指标与正常组比较无明显差异（p＞0.05）；最后处理动物，取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸（带附睾）及前列腺称重，求其脏器系数，实验结果表明，空白卷烟组和“江山”牌卷烟组大鼠脏器系数的与正常组比较无明显差异（p＞0.05）。组织学观察表明，停止吸烟15d后，空白卷烟组大鼠精子的生成恢复正常；肾脏亦有所恢复，与“江山”牌卷烟组比较无明显差异；心脏、肝脏和肺脏无明显恢复。
5 药效试验
5.1 “江山”牌卷烟对小鼠免疫功能的影响
选取体重18～22g的健康小白鼠，雌雄兼用。按体重和性别随机分为正常对照组、左旋咪唑组（2支空白卷烟/kg +左旋咪唑10mg/kg）、空白卷烟组（2支空白卷烟/kg）、“江山”牌卷烟小剂量组（1支空白卷烟/kg+1支江山/kg）和“江山”牌卷烟大剂量组（2支江山/kg）。将小鼠放入10000ml的容器内，用吸烟机吸烟，每分钟吸烟1次，每次2s，烟气量为35ml，并于2s内将烟气注入容器内；吸烟完成20min后，将小鼠从容器内取出，连续吸烟45d。
5.1.1 对免疫器官重量的影响
小鼠50只，雌雄兼用，分组吸烟后断颈处死动物，摘取脾脏和胸腺称重，求其脏器系数。结果表明，与空白卷烟组比较“江山”牌卷烟组小鼠脾脏有所增加，但无统计学意义（p＞0.05）。
5.1.2 对碳廓清率的影响
小鼠49只，雌雄兼用，分组吸烟后尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g(用生理盐水稀释4倍),分别于注射后2、10min，眼后静脉丛取血20μl,加入2ml 0.1% Na2CO3溶液中，摇匀，于675nm处比色，并称肝脾湿重，求廓清指数K和廓清系数α。结果表明，空白卷烟和“江山”牌卷烟对小鼠碳廓清率无明显影响（p＞0.05）。
5.1.3 DNFB诱导迟发型超敏反应的影响
小鼠58只，雌雄兼用，分组吸烟，于吸烟第38d腹部脱毛2×3cm，于吸烟第40天用1%DNFB丙酮麻油液（1:1）50μl均匀涂抹于去毛区致敏，于吸烟第45d用1%DNFB溶液10μl涂抹于小鼠左耳两面进行攻击。24h后处死动物，剪下两耳，用直径8mm打孔器在两耳同一部位打耳片，并称其重量，左右两耳重量之差即为肿胀度。结果表明，吸空白卷烟后小鼠耳肿胀度明显减小（p＜0.05）；与空白卷烟组比较，“江山”牌卷烟组小鼠耳肿胀度明显增加（p＜0.05），提示空白卷烟可明显抑制小鼠DNFB诱导迟发型超敏反应，而“江山”牌卷烟可明显拮抗空白卷烟抑制迟发型超敏反应的作用。
5.1.4 对溶血素水平的影响
选取小鼠59只，雌雄兼用，分组吸烟，于吸烟第38d腹腔注射2% SRBC 0.5ml/只进行免疫，吸烟完成24h后，摘除眼球取血，3000rpm 离心10min，分离血清，用生理盐水500倍稀释，取1ml，加0.5ml 5% SRBC和1ml 1:10补体，37℃水浴10min，冰水浴终止反应，取上清液1ml加3ml都氏液；同时取0.25ml 5% SRBC加4ml都氏液，摇匀，放置10min，作为半数溶血值。于540nm处比色，溶血素水平以半数溶血值HC50表示。结果表明，吸空白卷烟后小鼠溶血素水平明显降低（p＜0.05），“江山”牌卷烟可明显抑制空白卷烟降低小鼠溶血素水平的作用。
5.2 “江山”牌卷烟对大鼠血脂的影响
选取健康大白鼠45只，体重100～120g，雌雄兼用。按体重和性别随机分为正常对照组、空白卷烟组（3.6支空白卷烟/kg）、“江山”牌卷烟组（1.8支空白卷烟/kg+1.8支江山/kg）和“江山”牌卷烟组（3.6支江山/kg）。将大鼠放入10000ml的容器内，用吸烟机吸烟，每分钟吸烟1次，每次2s，烟气量为35ml，并于2s中内将烟气注入容器内。吸烟完成10min后，将大鼠从容器内取出，连续90d。断尾取血测定血清胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HPLC-C）和低密度脂蛋白（LPLC-C）含量。实验结果表明，吸空白卷烟后大鼠血清甘油三脂、胆固醇和低密度脂蛋白均明显升高（p＜0.05），“江山”牌卷烟组大鼠血清胆固醇和低密度脂蛋白与对照组比较无明显差异（p＞0.05），提示“江山”牌卷烟能明显拮抗空白卷烟升高血清胆固醇和低密度脂蛋白作用，对空白卷烟升高甘油三脂的作用无明显影响。
5.3 “江山”牌卷烟对小鼠LPO、SOD和GSH-Px的影响
选取体重18-22g的健康小白鼠，雌雄兼用。按体重和性别随机分为正常对照组、维生素E组（2支空白卷烟/kg + 维生素E 100mg/kg）、空白卷烟组（2支空白卷烟/kg）、“江山”牌卷烟小剂量组（1支空白卷烟/kg+1支江山/kg）和“江山”牌卷烟大剂量组（2支江山/kg）。将小鼠放入10000ml的容器内，用吸烟机吸烟，每分钟吸烟1次，每次2s，烟气量为35ml，并于2s内将烟气注入容器内；吸烟完成20min后，将小鼠从容器内取出，连续吸烟90d。
5.3.1 对小鼠脑、肝组织中过氧化脂质(LPO)的影响
处死动物，取脑、肝组织0.1g，加生理盐水2ml，匀浆，37oC振荡水浴1.5h，加20%三氯醋酸2ml，振荡静置10min，3000rpm 离心10min，取上清液1.5ml，加0.67% 硫代巴比妥酸 1ml，混合，沸水浴10min，冷却后于532nm处测OD值。实验结果表明，吸空白卷烟后小鼠脑组织中过氧化脂质的含量明显增高（p＜0.05）；吸“江山”牌卷烟后，小鼠脑、肝组织中过氧化脂质的含量与空白卷烟组比较明显降低（p＜0.05）。
5.3.2 对小鼠肝组织中超过氧化物酶(SOD)的影响
取pH 8.2缓冲液2.25ml，加0.05ml 10%肝匀浆及2ml双蒸水，25oC保温20min，然而加入25oC预温的邻苯三酚0.2ml（对照管用10mmol/L HCL），迅速摇匀，记录时间，4min后加10 mmol/L HCL一滴终止反应，于420nm处比色。实验结果表明，吸空白卷烟后小鼠肝组织中超过氧化物酶的活性明显降低（p＜0.05）；吸“江山”牌卷烟后，小鼠肝组织中超过氧化物酶的活性与空白卷烟组比较明显增高（p＜0.05）。
5.3.3 对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的影响
采血20μl，用蒸馏水稀释至1ml。取0.4ml（非酶对照管用蒸馏水），加1 mmol/L还原型谷胱甘肽和pH 7.0、0.4 mol/L磷酸缓冲液各0.4ml，37oC水浴3min；加1.25 mmol/L H2O2 0.2ml，37oC水浴3min；加偏磷酸钠液4.0ml，冰水浴沉淀蛋白，3000rpm 离心10min；取上清液2.0ml，加0.4 mol/L Na2PO4 2.0ml和0.04% 5,5’-二硫对硝基苯甲酸1.0ml，37oC水浴3min，于422 nm处比色。实验结果表明，吸空白卷烟和“江山”牌卷烟对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶的活性均无明显影响（p＞0.05）。
5.4 小结
研究了“江山”牌卷烟对小鼠免疫功能、对大鼠血脂及对小鼠组织LPO含量、SOD和GSH-Px活性的影响。免疫功能实验结果表明，吸空白卷烟后小鼠脾脏有所减小，小鼠耳肿胀度明显减小，明显抑制小鼠DNFB诱导迟发型超敏反应，并使小鼠溶血素水平明显降低；“江山”牌卷烟可明显抑制空白卷烟降低小鼠脾脏的作用，拮抗空白卷烟对小鼠DNFB诱导迟发型超敏反应的抑制作用，提高小鼠溶血素水平，提示空白卷烟对小鼠的非特异性免疫功能、细胞免疫功能和体液免疫功能有明显的抑制作用，而“江山”牌卷烟能明显拮抗空白卷烟对小鼠免疫功能的抑制作用。对大鼠血脂的影响实验结果表明，吸空白卷烟后大鼠血清甘油三脂、胆固醇和低密度脂蛋白均明显升高，“江山”牌卷烟组大鼠血清胆固醇和低密度脂蛋白与对照组比较无明显差异，提示“江山”牌卷烟能明显拮抗空白卷烟升高血清胆固醇和低密度脂蛋白作用，对空白卷烟升高甘油三脂的作用无明显影响。对小鼠组织LPO含量、SOD和GSH-Px活性实验结果表明，吸空白卷烟后小鼠脑组织中过氧化脂质的含量明显增高，吸“江山”牌卷烟后，小鼠脑、肝组织中过氧化脂质的含量与空白卷烟组比较明显降低；吸空白卷烟后小鼠肝组织中超过氧化物酶的活性明显降低；吸“江山”牌卷烟后，小鼠肝组织中超过氧化物酶的活性与空白卷烟组比较明显增高；而吸空白卷烟和“江山”牌卷烟对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶的活性均无明显影响。
6 抗“三致”研究
6.1 “江山”牌卷烟抑制烟草诱导淋巴细胞SCE交换频率和微核形成的研究
6.1.1 材料与方法
(一)供试样烟:“江山”牌卷烟、空白卷烟，共2000支，置于调温调湿平衡箱中平衡72h，挑取重量差异较小的卷烟备于试验。
(二)卷烟叶组乙醇提取液制备：相当20支的烟草在100ml 95% 乙醇中超声处理，抽滤，合并滤液，蒸馏浓缩至100 ml。
(三)试验分组：（1）空白对照组；（2）95% 乙醇对照组；（3）空白叶组组；（4）药物组；（5）药物+空白叶组组；（6）“江山”牌卷烟叶组组（7）“江山”牌卷烟主流烟气组。
(四)SCE标本制备：采集不吸烟个体静脉血，进行常规微量全血淋巴细胞培养。试验分为以上7组，每组设置3个平行组，并重复5次试验。根据20支/日/人的浓度进行加药。在37℃培养24h加入BRDU，继续培养至70h加入秋水仙素，72h常规染色体制备，并进行SCE显示。
(五)微核标本的制备：分组和培养条件同上，在37℃培养48h，用低渗液处理10分钟以使淋巴细胞膨大，Giemsa染色。
(六)数据分析处理：光镜下每组计数50个具有完整核型细胞的染色体SCE频率，以次/细胞为单位；在光镜下每组计数1000个淋巴细胞中的微核数，微核判定标准为与细胞核着色相同、脱离细胞核的光滑小体；所有处理组与对照组作t检验。
6.1.2 实验结果
(一)“江山”牌卷烟对烟草诱导淋巴细胞SCE频率的影响
不同浓度的空白烟叶组乙醇提取物组和“江山”牌卷烟烟气乙醇提取物，与空白对照组相比，淋巴细胞SCE频率存在显著性差异(p＜0.01和 p＜0.05＝。不同药物组合：空白对照组与药物组之间淋巴细胞SCE频率无显著性差异，与空白叶组组之间存在明显的显著性差异；空白叶组组与乙醇组、“江山”牌卷烟叶组组、“江山”牌卷烟烟气组和药物+空白叶组组淋巴细胞SCE频率SCE频率之间存在显著性差别，而在后4组之间无显著性差异(p＜0.01）。在重复试验之间，实验结果稳定。
(二)“江山”牌卷烟对诱导淋巴细胞微核形成的影响
不同浓度的空白叶组乙醇提取物组以及“江山”牌卷烟烟气乙醇提取物组与空白对照组相比，微核形成率存在显著性差异，而“江山”牌卷烟烟气乙醇提取物组与空白叶组乙醇提取物组的微核形成率也存在显著性差异。不同药物组之间微核形成率无显著性差异，其都与空白叶组组之间存在明显的显著性差异；乙醇组和药物组与空白对照组之间差异明显。在重复试验之间，实验结果也表现稳定。
6.1.3 讨论
淋巴细胞SCE频率和微核形成率是研究药物致畸的重要的指标。SCE频率反映了染色体断裂频率，而微核形成反映的是染色体断裂后，无着丝粒染色体片断遗留到细胞质中。本研究应用中草药添加，以降低烟草对染色体的损伤作用。结果显示，添加中草药成分明显降低由烟草诱导的淋巴细胞染色体SCE交换频率以及微核形成率，表明添加的中草药中存在保护染色体的成分。随“江山”牌卷烟主流烟气提取物的浓度升高，淋巴细胞SCE交换频率和微核形成率升高不明显；随空白叶组乙醇提取物浓度升高微核形成率略有上升，而SCE交换频率保持恒定，暗示20支/日/人的烟量就可达到致畸的较高水平。叶组乙醇提取液与酒精组相比，将提高淋巴细胞染色体SCE交换频率和微核形成率，表明其对染色体具有损伤作用。“江山”牌卷烟烟气组染色体SCE交换频率和微核形成率，与其它两个药物组之间无显著性差异，提示药物在燃烧后，仍有保护染色体的物质存在，这与“江山”牌卷烟主流烟气中中草药有效成分检测结果相一致（结果另文报道）。本研究结果也显示，乙醇可诱导淋巴细胞染色体SCE交换频率和微核形成率升高，并且叶组和乙醇在诱导淋巴细胞染色体SCE交换频率和微核形成率时，具有叠加效应。综上所述，“江山”牌卷烟中中草药添加剂可明显抑制烟草有害物质诱导人淋巴细胞SCE频率和微核形成的作用。
6.2 “江山”牌卷烟抑制烟草诱导鼠沙门氏菌突变的研究
6.2.1 材料与方法
(一)供试样烟
“江山”牌卷烟、空白卷烟，共2000支，置于调温调湿平衡箱中平衡72h，挑取重量差异较小的卷烟备于试验。
(二)卷烟叶组乙醇提取液制备：20支卷烟在25ml 95%乙醇中超声处理，布氏漏斗抽滤，合并滤液，减压蒸馏浓缩至25ml。
(三)试验分组：（1）空白卷烟组；（2）“江山”牌卷烟叶组组；（3）“江山”牌卷烟烟气组；（4）“江山”牌卷烟嘴棒组；（5）药物组；（6）二氨基芴阳性对照组；（7）95%酒精对照组。
(四)菌株：
选用鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株为实验菌株（购于中国预防科学院劳动卫生研究所）。试验前按Ames试验规定的方法对菌株进行鉴定，鉴定后合乎要求备用。
(五)微粒体酶制备：
用硫代巴比妥钠诱导大鼠，按Ames法制备S9混合液。
(六) “江山”牌卷烟提取物致突变性测定
采用标准皿掺入法在加S9和不加S9活化系统下进行试验。试验分组如下：取不同处理的提取物32μl加入到0.25mlS9混合物（或不加）中，并加入0.05ml菌液（1×107个菌/ml）混匀，置37℃水浴中30min活化。将预热45℃的1ml上层琼脂立即倒入上述已活化液内，摇匀倒入底层培养基上铺平。每种提取物作3个平皿，每种处理分别设置4个浓度：4μl、8μl、16μl、32μl。用酒精作为阴性对照组，二甲基芴作阳性对照组。试验平皿放置温箱内，37℃培养72h，记录回变菌落数。
(七)统计学数据处理
组内作平均值以及提取物浓度与回复突变的相关分析，不同浓度组间作方差分析。
6.2.2 实验结果
对不同处理的“江山”牌卷烟提取物诱导突变进行测定。并对实验结果进行相关回归分析和方差分析。
(一)不同处理卷烟提取物与突变菌落的相关回归分析
相关回归分析表明，空白卷烟提取物处理组浓度与突变菌落数之间直线回归方程为y=1.4444+0.2075x，相关系数r为0.9924，P＜0.0005，表明两者之间存在极相关。“江山”牌卷烟叶组组和“江山”牌卷烟烟气组提取物直线回归方程分别为y=1.7825+0.0481x和y=1.79+0.0425x，相关系数r分别为0.8381和0.8554， P值均＜0.05（3），说明两组均表现为显著相关关系。“江山”牌卷烟嘴棒组和药物组提取物直线回归方程分别为y=2.1+0.055和y=1.9963+0.0235x，相关系数r分别为0.7764和0.6368，P值均＞0.05（3），结果说明提取物浓度与菌落数目间无明显的相关性。
(二)不同浓度“江山”牌卷烟提取物对菌落数目影响的方差分析：
经方差分析表明，不同浓度空白卷烟提取物处理之间菌落数目存在显著性差异。 不同处理的江山卷烟叶组、烟气和嘴棒提取物，其不同浓度间菌落数目差异不显著。不同浓度的药物处理，菌落数目间无显著性差异。在重复试验之间，实验结果也表现稳定。
6.2.3 小结
根据Ames实验原理，测试物实验结果存在浓度效应或高于对照组3倍，可判定为致突变作用。本研究结果与其它学者相关研究结果一致。回归分析表明空白卷烟提取物浓度与沙门氏菌突变之间存在极明显的正相关性，空白卷烟提取物随着浓度的提高，诱导沙门氏菌突变越高；方差分析显示，不同浓度组间存在显著性差异，表现为浓度效应，并且32μl/皿浓度组突变高于酒精对照组5倍，说明烟草酒精提取物有致突变作用。“江山”牌卷烟叶组组、“江山”牌卷烟烟气组相关分析表明，提取物浓度与沙门氏菌突变之间有弱的正相关，但方差分析表明不同浓度组间差异不显著，并且最高酒精提取物致突变不高于酒精对照组3倍，说明此2组提取物浓度与沙门氏菌突变关系不密切。“江山”牌卷烟嘴棒组和药物组实验表明浓度与沙门氏菌突变间无相关，方差分析也支持不同浓度组间无显著性差异。本实验结果表明，“江山”牌卷烟叶组、烟气和嘴棒酒精提取物致突变的效应低于空白烟草提取物。
6.3 “江山”牌卷烟抑制烟草诱导CHO细胞转化的研究
6.3.1 材料与方法
(一)供试样烟
“江山”牌卷烟、空白卷烟，共2000支，置于调温调湿平衡箱中平衡72小时，挑取重量差异较小的卷烟备于试验。
(二)江山叶组乙醇提取液制备：20支的卷烟在25ml 95%中超声处理20min，布氏漏斗抽滤，共计3次。合并滤液，减压蒸馏浓缩至100 ml。
(三)试验分组：（1）空白叶组组；（2）“江山”卷烟叶组组；（3）“江山”卷烟烟气组；（4）“江山”卷烟嘴棒组；（5）药物组；（6）二氨基芴阳性对照组；（7）95%酒精对照组。
(四)细胞株:选用中国仓鼠卵巢成纤维细胞（CHO）为实验材料。
(五)微粒体酶制备:用硫代巴比妥钠诱导大鼠，制备活化混合液。
(六) “江山”卷烟提取物CHO细胞转化实验测定：采用软琼脂集落试验法在加或不加活化液下进行试验。在6孔培养板中，每孔加入3ml含5%琼脂的培养基，制备低层培养基，凝固备用。将受试物按不同剂量与3ml 1×104/ml的CHO细胞悬液混合，并加入0.25ml活化液，37℃下培养6h。接触处理结束后，迅速加入50℃ 5%琼脂0.2 ml，混匀，倒入低层培养基上。置于37℃，5% CO2孵箱中培养14d，统计集落数。
(七)统计学数据处理：组内作平均值以及提取物浓度与回复突变的相关分析，组间作差异分析。
6.3.2 结果分析
对不同处理的江山卷烟提取物CHO细胞转化测定。并对实验结果进行相关回归分析和方差分析。
(一)不同处理“江山”牌卷烟提取物与CHO细胞集落形成的相关回归分析:
空白卷烟、“江山”牌卷烟叶组、“江山”牌卷烟烟气提取物和“江山”牌卷烟嘴棒组不同浓度与CHO细胞集落形成之间不呈直线相关，即P＞0.05。“江山”牌卷烟嘴棒组不同浓度处理与CHO细胞集落形成之间呈直线相关，P＜0.05。但空白卷烟组与其它各组在诱导CHO细胞集落形成之间存在显著性差异，P＜0.05。
(二)不同浓度的“江山”牌卷烟提取物对菌落数目影响的方差分析：
经方差分析表明，不同浓度空白卷烟提取物处理液之间CHO细胞集落形成不存在显著性差异。但空白卷烟组与“江山”卷烟组、“江山”牌卷烟烟气和嘴棒提取物组，其CHO细胞集落形成存在显著性差异。“江山”牌卷烟嘴棒组不同浓度间存在差异。
6.3.3 小结
软琼脂集落实验是研究致癌物质致癌能力的重要手段。中国仓鼠卵巢成纤维细胞（CHO）正常情况下不能形成集落，而在致变剂存在时，可以发生转化形成集落。集落形成是肿瘤细胞的重要特点。
本研究结果显示，各组卷烟酒精提取物与酒精对照相比较，CHO细胞集落形成均存在显著差异，表明卷烟酒精提取物具有诱导肿瘤发生的作用。“江山”牌卷烟叶组、“江山”牌卷烟烟气和烟棒组与空白卷烟组的CHO细胞集落形成之间存在显著性差异，表明药物能部分降低烟草酒精提取物诱导肿瘤形成的作用。“江山”牌卷烟叶组集落形成略高于“江山”牌卷烟烟气组和嘴棒组，暗示药物燃烧产物抗癌变能力有所增强。本实验结果表明，添加抗突变中药成分的烟草、烟气和嘴棒酒精提取物癌效应低于空白烟草提取物。
7 人群观察试验研究
7.1 观察对象
由于吸烟人群的复杂性，决定了在观察对象的选择上要有不同职业，不同年龄，不同生存环境，不同饮食习惯等多方面的考虑，故我们在观察对象的布点上分别选择了农民、工人、军人、干部、医生等不同人群、长期吸烟而不愿戒除的健康自愿者54人，年龄在20～60岁之间，无吸烟禁忌症者为研究对象。
7.2 观察方法
每人每天20支，连续60d为一观察周期，观察前后检查相关指标。
7.3 观察内容
7.3.1 脉搏、血压，每周检测一次，作详细记录。
7.3.2 相关指标，观察前后各检测1次。
7.4 观察指标
7.4.1 血常规：Hb、RBC、WBC、PLT
7.4.2 肝功、肾功：ALP、CR
7.4.3 T细胞亚群：CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+
7.4.4 免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA
7.4.5 血脂：TC、TG、HDL-C、LDL-C
7.4.6 血液流变学：ηH、ηL、ηP、Q
7.4.7 性腺：T、FSH、LH
7.4.8 心电图
7.4.9 胸片
7.5 统计学处理
各参数均以均数±标准差（X±S）表示。应用美国SAS统计软件进行样本配对t检验。P＜0.01为显著性差异，P＞0.05无统计学意义。
7.6 观察指标选择
7.6.1 免疫指标
7.6.2 血粘度及血脂测定
7.6.3 胸片
7.6.4 性腺激素
7.7 观察及结果
7.7.1 “江山”牌卷烟对人体免疫功能的影响
（一）T细胞亚群检查：分别于观察前后检测吸烟者外周血T细胞亚群CD4+、CD3+、CD8+、CD4+/ CD8+。实验结果表明，CD4+明显升高，（P＜0.01），CD8+降低，（P＜0.01），CD4+/CD8+上升（P＜0.01）。
（二）免疫球蛋白检测：实验结果表明，观察前后IgG、IgA和IgM无明显变化。
7.7.2 “江山”牌卷烟对胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的影响
实验结果表明，低密度脂蛋白明显降低（P＜0.01），胆固醇、甘油三脂和高密度脂蛋白等无显著性影响（P＞0.05）。
7.7.3 “江山”牌卷烟对人体性腺激素的影响
实验结果表明，观察前后人体性腺激素T、LH、FSH无明显变化（P＞0.05）。
7.7.4 “江山”牌卷烟对人体血粘度的影响
实验结果表明，纤维蛋白原明显降低（P＜0.01）。
7.7.5 安全性评估
(一)本次观察54例，每人每天吸食“江山”牌卷烟20支，连续60d观察咽喉肿痛、咳嗽、晨起咳痰、胸闷等症状明显改善，在整个观察过程中无不良反应和过敏反应发生。
(二)观察前后血压、脉搏变化。
实验结果表明，观察前后收缩压、舒张压和脉搏无明显变化。
(三)观察前后血象变化。
实验结果表明，观察前后血红蛋白、红细胞数、血小板数、白细胞数及其分类无明显变化。
(四)观察前后肝肾功变化。
实验结果表明，观察前后谷丙转氨酶和肌酐无明显变化。
(五)观察前后心电图变化。
实验结果表明，观察前后心电图正常。
(六)观察前后胸片变化。
实验结果表明，观察前后胸片正常。
7.8 小结
通过对54例自愿吸烟者吸食“江山”牌卷烟60d的观察，结果表明，吸食“江山”牌卷烟后，咳嗽痰多，胸闷，咽痛，乏力等症状明显改善，并有较好的改善咽部不适，改善体力等作用。
通过对54例吸食“江山”牌卷烟60d后的外周血T细胞亚群实验结果表明，CD4+明显升高，（P＜0.01），CD8+降低，（P＜0.01），CD4+/CD8+上升（P＜0.01），提示吸食“江山”牌卷烟后可明显提高机体的细胞免疫水平；血液流变学实验结果表明，低密度脂蛋白明显降低（P＜0.01），纤维蛋白原明显降低（P＜0.01），胆固醇、甘油三脂等无显著性影响（P＞0.05），提示对形成动脉硬化的部分因素有降低作用。
8 中草药有效成分转移率研究
8.1 试剂及材料
硅胶G(青岛海洋化工集团公司)；淫羊藿苷、芍药苷
对照品(中国药品生物制品检定所 批号：0736- 9912)；甲醇(HPLC-Grand 美国Fisher公司)；其它试剂均为分析纯；“江山”牌卷烟、空白卷烟。
8.2 试液的制备
8.2.1 对照品溶液的制备
精密称取恒重的对照品适量,用甲醇制备成浓度为0.005mg•ml-1的溶液备用。
8.2.2 “江山”牌卷烟烟丝供试品溶液的制备
取挑选后的“江山”牌卷烟200支，取出烟丝，在50℃烘烤2h，取1/5烟丝精密称重，放入锥形瓶中，加入分析纯甲醇，超声提取，收集提取液，滤过，合并滤液，减压蒸干，残渣用蒸馏水转溶至500ml分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取至无色，合并萃取液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解于10ml量瓶内，加甲醇至刻度，备用。
8.2.3 空白卷烟烟丝供试品溶液的制备
取空白卷烟200支，取出烟丝，在50℃烘烤2h，取1/5烟丝精密称重，放入锥形瓶中，加入分析纯甲醇，超声提取，收集提取液，滤过，合并滤液，减压蒸干，残渣用蒸馏水转溶至500ml分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取至无色，合并萃取液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解于10ml量瓶内，加甲醇至刻度，备用。
8.2.4 “江山”牌卷烟主流烟气供试品溶液的制备
取挑选后的“江山”牌卷烟80支，在吸烟机上进行燃吸、并按国际标准ISO:3308收集烟气总粒相物（TPM）于剑桥滤片上，将滤片取下，用脱脂棉擦洗捕集器内壁，滤片与脱脂棉一并放入具塞三角瓶中，加入甲醇，超声提取，收集提取液，滤过，合并滤液，减压蒸干，残渣用蒸馏水转溶至500ml分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取至无色，合并萃取液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解于10ml量瓶内，加甲醇至刻度，备用。
8.2.5 空白卷烟主流烟气供试品溶液的制备
取空白卷烟80支，在吸烟机上进行燃吸、、并按国际标准ISO:3308收集烟气总粒相物（TPM）于剑桥滤片上，将滤片取下，用脱脂棉擦洗捕集器内壁，滤片与脱脂棉一并放入具塞三角瓶中，加入甲醇，超声提取，收集提取液，滤过，合并滤液，减压蒸干，残渣用蒸馏水转溶至500ml分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取至无色，合并萃取液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解于10ml量瓶内，加甲醇至刻度，备用。
8.2.6 “江山”牌卷烟滤嘴供试品溶液的制备
取挑选后的“江山”牌卷烟80支，在吸烟机上进行燃吸、将燃吸后卷烟滤嘴剥去水松纸，放入具塞三角瓶中，加入甲醇，超声提取，收集提取液，滤过，合并滤液，减压蒸干，残渣用蒸馏水转溶至500ml分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取至无色，合并萃取液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解于10ml量瓶内，加甲醇至刻度，备用。
8.2.7 空白卷烟滤嘴供试品溶液的制备
取挑选后的空白卷烟80支，在吸烟机上进行燃吸、将燃吸后卷烟滤嘴剥去水松纸，放入具塞三角瓶中，加入甲醇，超声提取，收集提取液，滤过，合并滤液，减压蒸干，残渣用蒸馏水转溶至500ml分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取至无色，合并萃取液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解于10ml量瓶内，加甲醇至刻度，备用。
8.3 色谱条件
8.3.1 TLC条件
展开剂:乙酸乙酯-氯仿-甲酸-水(10∶1∶1∶1 V/V/V/V)
硅胶G自制板(20cm×20cm 0.5mm)
365nm紫外灯下检视
8.3.2 HPLC条件
色 谱 柱： ODS柱(150mm×4.6mm 5μ I.D.)
流 动 相： 乙腈-水(25∶75 V/V)
检测波长： 270nm
流 速： 0.8ml/min
进 样 量： 20μL
8.4 结果与讨论
8.4.1 标准曲线的制备
分别吸取
对照品溶液(0.005mg•ml-1)2、5、10、15、20μl,在拟定的色谱条件下分析，以进样量(μg)对峰面积回归得方程为
Y＝3015.1X－3.6634 (r=0.9995 n=5)
结果表明对照品溶液在0.01 ～0.1 间有良好的线性关系。
8.4.2 回收率试验
采用空白加样法测定。按空白卷烟烟丝、主流烟气、滤嘴采样方法采集空白卷烟烟丝、主流烟气及滤嘴，分别在各自的有机溶剂提取液中加入一定量的对照品溶液，然后按照“江山”牌卷烟烟丝、主流烟气、滤嘴样品的制备方法处理，即得回收率试验品溶液。
精密吸取各个供试品溶液20μl,在拟定色谱条件下进样，记录峰面积，计算回收率，计算平均回收率为：95.69%。结果表明该方法的回收率较高。
8.4.3 精密度试验
精密吸取“江山”牌卷烟烟丝、主流烟气、滤嘴供试品溶液各20μl，在拟定的色谱条件下分别连续进样5次，记录峰面积，RSD=0.68%。结果表明该方法具有良好的精密度。
8.4.4 重现性试验
按“江山”牌卷烟烟丝、主流烟气、滤嘴供试品溶液的处理方法，各种样品平行处理5份，分别吸取20μl，在拟定色谱条件下连续进样5次，记录峰面积，RSD=1.12%。结果表明该方法重现性良好。
8.5 含量测定
8.5.1 淫羊藿苷含量测定
(一)“江山”牌卷烟烟丝中淫羊藿苷含量测定
精密吸取烟丝提取液10μl,在拟定色谱条件下对五组样品进样分析，由外标法计算含量。
(二) 卷烟滤嘴中淫羊藿苷含量计算
精密吸取“江山”牌卷烟滤嘴供试品溶液20μl,在拟定色谱条件下对五组样品进样分析，外标法计算含量。
(三) “江山”牌卷烟烟气中淫洋藿苷含量计算
精密吸取卷烟总粒相物提取液10μl,在拟定色谱条件下对五组样品进样分析，外标法计算含量。
8.5.2 芍药苷含量测定
(一) “江山”牌卷烟烟丝中芍药苷含量测定
精密吸取烟丝提取液10μl,在拟定色谱条件下对五组样品进样分析，由外标法计算含量。
(二)卷烟滤嘴中芍药苷含量计算
精密吸取“江山”牌卷烟滤嘴供试品溶液20μl,在拟定色谱条件下对五组样品进样分析，外标法计算含量。
(三) “江山”牌卷烟烟气中芍药苷苷含量计算
精密吸取卷烟总粒相物提取液10μl,在拟定色谱条件下对5组样品进样分析，外标法计算含量。
9 结论
9.1 对中草药理论、中草药提取分离和配方技术，添加中草药的低危害“江山”牌卷烟的配方技术、相关工艺进行了研究，解决了低危害“江山”牌卷烟协调性问题，形成了一套比较完善低危害“江山”牌卷烟配方技术，设计出一套合理的低危害“江山”牌卷烟在线工艺标准。
9.2 研究了中草药对卷烟烟气中有害物质的降低作用，建立了“江山”牌卷烟烟气中中草药有效成份的捕集方法，测定了中草药的捕集转移率。
9.3 应用该技术研制出的低危害“江山”牌卷烟主流烟气中中草药有效成分淫羊藿苷含量3.06μg/支，芍药苷含量9.23μg/支；主要有害成分苯并[a]芘降低21.9%，烟草特有N-亚硝胺类降低26.3%。
9.4 低危害“江山”牌卷烟对肾脏、心脏及精子生成的损伤程度明显小于空白卷烟，可以有效地降低卷烟的毒副作用；能明显拮抗空白卷烟烟气对非特异性免疫功能和特异性免疫功能的抑制作用，能降低脑、肝组织过氧化脂质的含量，调节血脂代谢；明显降低卷烟致畸、致突变和致癌变作用；有较好的改善咽部不适，改善体力等作用，可明显提高机体的细胞免疫水平，对形成动脉硬化的部分因素有降低作用。
|  | |
工具栏 